IL MICROARRAY
a cura di Annamaria Colacci, Monica Vaccari,
Paola Silingardi, Wolfango Horn
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Per determinare
velocemente se un agente chimico è in grado di danneggiare
l'organismo è possibile utilizzare questo protocollo, al
fine di rispondere alla seguente domanda:"l'agente altera l'attività
dei geni nelle cellule in modo tale da causare o riflettere un danno
cellulare?"
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1
Disporre di un microarray o chip, contenente DNA a singolo filamento,
che rappresenta migliaia di geni, ognuno disposto in uno specifico
spot. Ogni spot comprende migliaia di copie di filamenti di DNA. |
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2
Esporre le cellule al composto in esame. Poi, raccogliere l'RNA
messaggero (mRNA), la copia trasferibile dei geni e stampo per la
sintesi proteica nella cellula. |
3
Trascrivere l'mRNA nel più
stabile DNA complementare (cDNA) e marcare con sonde fluorescenti
(verde il cDNA delle cellule non trattate, rosso quello delle
trattate).
4 Applicare i cDNA marcati al chip. Il legame si ottiene
quando il cDNA del campione trova la sequenza di basi complementari
sul chip. Tale legame significa che il gene presente nel chip
era attivo o "espresso" nel campione. |
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5
Mettere il chip in uno scanner. Il computer calcola il rapporto
di marcature rosso/verde di ogni spot (per quantificare ogni variazione
di attività genica indotta dal composto) e generare la lettura |
6
Osservare se esiste una
modulazione a carico di geni possibilmente coinvolti in un
quadro noto di danno da sostanze tossiche. Paragonare il pattern
complessivo di espressione a quello già conosciuto
caratteristico di danno: strette somiglianze possono deporre
per una possibile tossicità del composto in esame.
Nel diagramma, ogni casella rappresenta la risposta di un
singolo gene al composto. |
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